CCK8試劑用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
1.將處于對數(shù)生長期的各實(shí)驗組細(xì)胞胰酶消化后，*培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并計數(shù)。
2.根據(jù)細(xì)胞生長快慢決定鋪板細(xì)胞密度(多數(shù)為1000-2000 cell/well)，每組3-5重復(fù)，每孔100-200μl培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗設(shè)計決定鋪板數(shù)量(如需要檢測5天，則鋪5張96孔板)，我們以1000 cell/well，5復(fù)孔，200μl培養(yǎng)基，檢測5天為例，各實(shí)驗組需要細(xì)胞數(shù)量為1000×5×5個細(xì)胞，從計數(shù)好的細(xì)胞懸液中取出所需的細(xì)胞量和*培養(yǎng)基混勻，體積為200×5×5μl。
3.統(tǒng)一鋪好后，待細(xì)胞*沉淀下來后，在顯微鏡下觀察各實(shí)驗組的細(xì)胞密度，如果密度不均勻，則固定一組，微調(diào)其他組細(xì)胞的量再次鋪板(如：發(fā)現(xiàn)NC組細(xì)胞較多，降低細(xì)胞量再次鋪板)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4.從鋪板后開始，每孔加入10-20μl CCK-8溶液，如果每孔的培養(yǎng)基為100μl，則加入10μl CCK-8溶液，如果每孔的培養(yǎng)基為200μl，則加入20μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數(shù))。用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。
5.在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時，對于大多數(shù)情況孵育2小時左右就可以了。
6.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度(使用酶標(biāo)儀之前要提前開啟10min預(yù)熱)測定完成后，保存數(shù)據(jù)。
7.連續(xù)五天檢測，每天保持一樣的時間點(diǎn)加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時間相同。
注：若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。
